长期属于冷门，2013年引发结构生物学革命，2017年折桂诺奖……北大医学部电镜室主任回顾冷冻电镜前世今生，拆解问鼎诺奖正确途径。（更多内容请看“2017诺贝尔奖专题”）
文/尹长城
北京大学医学部生物物理学系教授、
分析中心电镜室主任、
中国生物物理学会冷冻电镜分会副理事长、
中国电子显微学会低温电镜专业委员会主任
编辑/吉菁菁 新媒体编辑/陈炫之
2017年诺贝尔化学奖授予三位冷冻电镜领域的学者瑞士洛桑大学的雅克?杜波切特(Jacques Dubochet)、美国哥伦比亚大学乔基姆?弗兰克(Joachim Frank)和英国剑桥MRC分子生物学实验室的理查德?亨德森（Richard Henderson），奖励他们对冷冻电镜技术的发展做出的原创性贡献。
冷冻电镜是何方神器？为什么赢得诺贝尔奖？本人曾在理查德?亨德森（Richard Henderson）所在的英国剑桥MRC分子生物学实验室学习冷冻电镜，与其有师生之谊；另两位诺贝尔奖得主雅克?杜波切特（Jacques Dubochet）和乔基姆?弗兰克(Joachim Frank)我也有交往，对他们非常熟悉。在此对冷冻电镜技术和三位科学家的成就加以介绍，并对为什么冷冻电镜技术获得诺贝尔奖进行评介，最后谈谈冷冻电镜技术获得诺贝尔奖对我们的启示。
01
冷冻电镜引发结构生物学革命，
单颗粒技术将分辨率提升至原子
要想了解冷冻电镜是何方神器，首先要了解结构生物学。结构生物学是应用物理学方法在原子水平阐明生物大分子的三维结构及其动态变化，进而诠释生物大分子的生物学功能及其执行功能的工作机制的科学。
结构生物学起源于理查德?亨德森所在的英国剑桥MRC分子生物学实验室（MRC Laboratory of MoIecular Biology, 简称MRC-LMB），于上个世纪30年代开始于马克斯?佩鲁茨（Max Perutz）和约翰?肯德鲁（John Kendrew）以及吉姆?沃森（Jim Watson）和弗朗西斯?克里克（Francis Crick）应用X-射线晶体学方法研究蛋白质（血红蛋白）和DNA的结构。
▲当年轰动世界的DNA双螺旋结构的发现，就是因为研究出了利用X光射线去研究DNA的衍射的方法。
血红蛋白的结构解析和DNA双螺旋结构的破解导致了生物学的革命——生命科学从对生命现象的定性宏观描述阶段进入了对生命现象的分子机制的微观描述阶段，即进入了分子生物学时代。马克斯?佩鲁茨（Max Perutz）和约翰?肯德鲁（John Kendrew）因此获得1962年诺贝尔化学奖，吉姆?沃森和弗朗西斯?克里克则获得了同年的诺贝尔生理学及医学奖。
冷冻电镜（cryo-electron microscopy, 简称cryo-EM）是一种结构生物学技术，其解析结构的方法是通过用电子显微镜对冷冻固定在玻璃态的冰中的生物大分子进行成像，然后应用计算机对所摄取的生物大分子图像进行图像处理和计算，进而重构出生物大分子的三维结构。 冷冻电镜结构解析的理论基础是电镜三维重构原理，由MRC分子生物学实验室的亚伦?克卢格（Aaron Klug）及其同事戴维德罗斯特（David DeRosier）于1960年代建立。
该原理基于数学中的傅立叶变换相关的中央截面定理和傅立叶变换的性质。中央截面定理可表述如下：一个三维函数的投影函数的傅立叶变换等于该三维函数傅立叶变换通过坐标原点且垂直于投影方向的截面函数。将这个定理应用于电镜图像：一个三维物体的电镜图像的傅立叶变换等于该三维物体的傅立叶变换通过物体中心（设定为坐标原点）并垂直于摄像方向的截面。傅立叶变换具有如下性质：一个函数的傅立叶变换的逆傅立叶变换等价于原来的函数。根据中央截面定理和傅立叶变换的性质，一个三维函数的n个不同方向的投影函数傅立叶变换的集合等价于该三维函数的三维傅立叶变换，对此三维傅立叶变换做逆傅立叶变换则等价于恢复原三维函数。
将这一原理应用于电镜图像：一个物体（如蛋白质、病毒、细胞器、细胞）的三维结构的不同方向所摄取的n个电镜图像的傅立叶变换的集合等价于该物体三维结构的三维傅立叶变换，对此三维傅立叶变换做逆傅立叶变换等价于恢复原物体的三维结构。这个原理奠定了电镜解析物体三维结构的基石，所有用电镜解析物体三维结构的方法都是基于这个原理。由于这一贡献，亚伦?克卢格荣获1982年诺贝尔化学奖。
虽然亚伦?克卢格及其同事早在1960年代就提出了电镜三维重构原理，但由于当时如何保持生物大分子的结构信息并用电镜收集这些信息再用计算机对这些信息进行处理的技术还不成熟，因此，截止到2013年，只有在平面形成一层高度有序排列的蛋白质分子样品（在电镜领域称为“二维晶体”，two-dimensional crystal）才能应用冷冻电镜解析结构。
▲冷冻电镜三维重构得到的电子云密度图和原子模型(局部)
2013年以后，由于冷冻电镜关键技术的突破，使得分散的蛋白质分子样品（在电镜领域称为“单颗粒”，single particle）也能应用冷冻电镜解析结构。可以说冷冻电镜关键技术的突破性进展，导致结构生物学发生了革命。
在此过程中，雅克?杜波切特、乔基姆?弗兰克和理查德?亨德森做出了开创性的贡献，因此诺贝奖授予他们实至名归。
如何保持生物大分子的结构信息？
1974年，美国加州大学伯克利分校Lawrence Berkeley实验室的罗伯特?格莱斯（Robert Glaeser）及其学生肯尼思?泰勒（Kenneth Taylor）发现，如果把生物大分子catalase的二维晶体快速冷冻，他们观察到晶体的电子衍射可到3Å，即原子分辨率，说明快速冷冻可保持生物大分子的结构信息。但由于生物大分子的二维晶体很难获得，因此以二维晶体为材料解析结构的方法难以推广，亟需发明一个以非晶的生物大分子（称为单颗粒，single particle） 为材料的普适性方法。
▲冷冻电镜样品制作流程。
1984年，当时在德国欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory, 简称EMBL）工作的雅克?杜波切特受到格莱斯工作的启发，把非晶的生物大分子（二十面体病毒）直接在电镜载网上形成薄膜并快速冷冻，发现如此冷冻的生物大分子同样可保持结构信息。雅克?杜波切特的开创性工作因此导致了今天广泛应用的单颗粒冷冻电镜技术的诞生。
如何从冷冻在一层薄冰中的生物大分子电镜图像中提取结构信息，是应用冷冻电镜技术解析结构的另一个需要解决的关键问题。乔基姆?弗兰克对此做出了开创性贡献。
早在雅克?杜波切特发明生物大分子单颗粒快速冷冻方法之前，乔基姆?弗兰克就探讨了如何从分散在电镜载网上的生物大分子单颗粒电镜图像提取结构信息的图像处理和三维结构计算方法，并研发了第一个软件包SPIDER。
此后，又有多个学者研发了针对冷冻电镜生物大分子单颗粒电镜图像处理和三维结构计算方法并开发了相应的软件包，如美国贝勒医学院史提夫吕特克（Steve Ludtke） 和美国国家科学院院士赵华（Wah Chiu）研发的EMAN，美国布兰迪斯大学尼古拉?格里戈列夫（Nicola Grigorieff）（曾在英国剑桥MRC分子生物学实验室理查德?亨德森实验室做博后）研发的FREALIGN和英国剑桥MRC分子生物学实验室舍尔斯（Sjors Scheres）研发、目前广泛使用的RELION。
▲冷冻电镜中流行的图像处理软件
虽然由于快速冷冻技术和电镜单颗粒图像处理技术的发明，使得应用生物大分子单颗粒冷冻电镜可以解析结构，但是还有一些关键问题没有解决，限制了冷冻电镜解析结构到原子分辨率。
2004年，理查德?亨德森对冷冻电镜单颗粒技术做了理论分析，指出冷冻电镜单颗粒技术理论上完全可以将结构解析到原子分辨率，并指出了技术上需要克服的关键问题：第一是提高冷冻电镜图像的信噪比，第二是克服冷冻电镜图像在摄像时的漂移。理查德?亨德森的理论分析为冷冻电镜的发展指明了方向，并提出了解决问题的方案。
▲冷冻电镜技术和单颗粒重构技术越来越备受关注(统计数据来源于EMDataBank )
(a)不同年份中利用冷冻电镜单颗粒重构技术能够达到的最高分辨率；(b)通过冷冻电镜技术进行的研究成果在不同杂志上发表的论文数
2013年，美国加州大学旧金山分校的旅美华人学者程亦凡与大卫?阿加德（David Agard）（曾在英国剑桥MRC分子生物学实验室理查德?亨德森实验室做博后）把直接电子探测器（direct detection device，简称DDD）用于冷冻电镜单颗粒电镜图像记录。
DDD直接记录电子信号，降低了点扩散效应，由于无需电子-光学信号转换，保持了原始信号的强度。因此，用DDD纪录的图像分辨率高、信噪比高、信号强。由于DDD摄取的电镜图像信号强、信噪比高，因此可对图像产生的漂移进行校正后叠加平均，消除由于样品漂移导致的图像模糊，提高了电镜图像的分辨率。
DDD的引入，同时克服了理查德?亨德森指出的技术上需要克服的两个关键问题，实现了冷冻电镜单颗粒技术将结构解析到原子分辨率的梦想。
02
冷冻电镜把生物大分子运动过程视觉化，
是生命科学领域的“金刚钻”
▲2013年，电镜技术达到了原子级分辨率后，我们能看到的微观世界从图左变成了图右。
在谈冷冻电镜技术为什么获得诺贝尔奖之前，首先谈谈为什么要做结构和为什么做结构要做到原子分辨率。
现代物理学和化学告诉我们，任何物质包括生命物质都是由分子或原子组成的，而分子又是由原子组成的。物质的性质和功能是由其结构决定的，“结构决定功能”是自然界的法则，生命物质也不例外。物质的性质和功能取决于构成物质的分子之间的相互作用，而分子间的相互作用又取决于构成分子的原子之间的相互作用。
必须在原子层次上了解分子的结构，了解在微观层次上构成分子的原子如何相互作用，才能从根本上理解分子所具有的功能。不仅只有在原子分辨率水平解析生物大分子的结构，才能理解生物大分子的功能，而且只有在原子分辨率水平解析生物大分子复合体的结构，才能从根本上理解生物大分子之间的相互作用及其由相互作用导致的新功能。这就是为什么要做生物大分子及其复合体的结构的根本原因，也是为什么诺贝尔奖持续授予生物大分子结构及其结构解析技术领域的原因。
在冷冻电镜单颗粒技术能够解析生物大分子结构至原子分辨率之前，结构解析主要依靠X-射线晶体学技术和核磁共振技术。
生物大分子X-射线晶体学技术和核磁共振技术也分别于1962年和2002年赢得诺贝尔奖（马克斯?佩鲁茨和约翰?肯德鲁，英国剑桥MRC 分子生物学实验室，1962年化学奖；库尔特?维特里奇（Kurt Wiithrich），瑞士苏黎世联邦理工学院，2002年化学奖）。
X-射线晶体学技术解析结构有如下问题：第一，所研究的生物大分子或其复合物必须是晶体的形式，而生物大分子特别是多个蛋白的复合物难以长成晶体，如施一公研究的剪接体复合物几乎不可能长成晶体，因此不能用X-射线晶体学技术解析结构；第二，生物大分子或其复合体在晶体中被固定在某种单一结构（称为构象），因此，用X-射线晶体学技术解析的结构是静态的、单一的结构。
▲直接电子探测器（direct detection device，简称DDD）和电子藕合探测器技术（CCD）相比，可能就是单反相机和卡片机的区别。图为利用X射线晶体学方法拍摄的蛋白质晶体
核磁共振技术由于研究的生物大分子处于溶液之中，因此可以解析动态结构。但是，由于所能产生磁场强度的限制，导致核磁共振技术所能解析的生物大分子的大小有限，目前只能解析分子量小于100kDa的蛋白质的结构。而生物体中很多蛋白质的大小都超过100kDa，生物大分子复合体更是如此，这极大地限制了核磁共振技术在结构解析中的应用。
单颗粒冷冻电镜技术的突破克服了X-射线晶体学技术和核磁共振技术的限制。首先，冷冻电镜单颗粒技术对蛋白质或其复合物的大小没有上限，小到分子大到细胞都可应用，这克服了核磁共振技术的缺点；第二，冷冻电镜图像处理算法的突破，可以将同一蛋白质或复合体不同的分子构象分开，同时重构到原子分辨率，这克服了X-射线晶体学技术解析的结构是静态的、单一的结构的缺点。
如果能结合功能信息，确定不同构像在生物大分子或复合体行使功能过程中的时间顺序，人们就可揭示生物大分子或复合体执行功能的结构变化，从而从根本上阐明生物大分子的工作机制。
冷冻电镜技术的突破，把结构生物学从“静态结构生物学”变成了“动态结构生物学”，把结构和功能真正对应起来。
03
原创性创新是诺奖的源泉，
打开诺奖大门的多是“冷门”问题
冷冻电镜领域里，为何是雅克?杜波切特、乔基姆?弗兰克和理查德?亨德森这三位科学家摘了诺贝尔化学奖的桂冠？根本原因在于诺贝尔奖强调奖励科学发现的原创性。
这三位科学家各自在冷冻电镜技术发展中做出了原创性贡献：理查德?亨德森在理论上为冷冻电镜技术发展指明了方向；雅克?杜波切特在单颗粒冷冻技术上导致单颗粒冷冻电镜的诞生；而乔基姆?弗兰克则是在单颗粒冷冻电镜算法上实现了冷冻电镜不用晶体解析结构。
杜波切特的玻璃化方法：
▲1984年，杜波切特在用玻璃化方法得到第一张被水包围着的病毒图像。
所以，科学发现的原创性才是诺贝尔奖的源泉，这种原创性更重要的是思想（idea）上的原创性，无论上理论上还是实践上，第一才是最重要的，这是冷冻电镜技术获诺贝奖的第一个启示。
中国人一直有诺贝尔情结，2015年，屠呦呦获奖使中国人看到了希望，看到了未来，认为中国人获得诺贝尔奖的时代已经到来。我们必须保持清醒的头脑，充分认识什么样的科学发现可以赢得诺贝尔奖。
如前所述，诺贝尔奖强调的是科学发现的原创性。什么是原创性？原创性就是第一，是从来没有人做过的问题，是“冷门”问题，不是“热点”问题。“热点”问题是有人开创之后，人们才都感兴趣，纷纷去做的问题，肯定不是原创性问题，难以赢得诺贝奖。如果不认识到这一点，中国人获得诺贝尔奖就是个案。
在冷冻电镜技术的发展处于低谷的艰难时期，理查德?亨德森仍坚持认为冷冻电镜技术总有一天会取得突破，成为结构生物学的主流。他的观点遭到了很多人的嘲笑，认为他的预言是梦想。理查德?亨德森不为所动，坚持不懈，推动冷冻电镜技术的发展，终于修成正果。
国人常常热衷于“热点问题”，热衷于发表CNS论文，认为CNS论文代表的是科学最高水平，是获得诺贝尔奖的资本。中国大学和研究所招人也非CNS不取。这是一个不正确的导向。在CNS发表论文也许代表科学研究的最高水平，但不是诺贝尔奖的标准。
科学发现的原创性才是诺贝尔奖的标准，理查德?亨德森只在Nature上发表过1篇论文，此次获诺贝尔奖并不是由于那篇Nature论文，而是由于他在一个影响因子不高的期刊上发表的对冷冻电镜技术的原创性理论分析和他对整个冷冻电镜领域发展的推动性贡献。
理查德?亨德森高瞻远瞩，不仅在理论上做出了原创性贡献，而且独具慧眼，在推动冷冻电镜技术的发展上也做出了突出贡献。正是由于他看到当时没有什么大文章（注：没有一篇CNS）的舍尔斯（Sjors Scheres）的发展潜力，将其引进剑桥MRC分子生物学实验室，推动了对冷冻电镜单颗粒结构解析起关键作用的软件包RELION的发展； 同时，他对冷冻电镜单颗粒结构解析起关键作用的DDD的发展也做出了重要贡献。
同样，乔基姆?弗兰克获奖也不是因为他发表了一大堆CNS论文，而是由于他在单颗粒冷冻电镜算法上做出了原创性贡献，实现了冷冻电镜不用晶体解析结构。
因此，看准方向，坚持不懈，做别人没有做过的“冷门”问题，才是获诺贝尔奖的正确途径，这是冷冻电镜技术获诺贝奖的第二个启示。
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